Agent 47 (Timothy Olyphant) - kurz allgemein nur "47" genannt - ist der Hitman - ein Auftrageskiller. Er selbst ist in einem Gen-Labor als Teil eines gewagten Experiments entstanden. Seine DNS wurde aus derjenigen von fünf Schwerverbrechern zusammengesetzt. Großgezogen wurde er durch eine aus der Kirche ausgestoßene Bruderschaft.
Eines Tages erhält der Hitman den Auftrag, den russischen Präsidenten Mikhail Belicoff (Ulrich Thomsen) zu töten. 47 schießt mit einem Präzisionsgewehr aus über vier Kilometern Entfernung und trifft genau in den Kopf. Anscheinend hat er seine Mission erfüllt.
Doch zurück in seinem Hotelzimmer, muss 47 erfahren, dass das Attentat fehlgeschlagen sein soll: Belicoff hat überlebt. Und schlimmer noch: Es soll eine Zeugin geben, die Prostituierte Nika Boronina (Olga Kurylenko), die den Hitman bei seiner Tat beobachtet habe.
47 macht sich auf die Suche nach Nika, doch er stellt bald fest, dass sie durchaus keine Zeugin ist. Die beiden haben sich noch nie gesehen. Offenbar will jemand Nika nur "billig" aus dem Weg geräumt haben und hofft dabei auf die Mithilfe des Profikillers. Außerdem keimt in ihm der Verdacht, dass sein Schuss vielleicht doch nicht fehl ging, und die Rolle des russischen Präsidenten inzwischen ein Doppelgänger eingenommen hat.
Doch übermaßig viel Zeit zum Nachdenken hat 47 so oder so nicht: Zwischenzeitlich ist der Hitman nämlich vom Jäger zum Gejagten geworden. Ganze Horden von Spezialagenten verfolgen ihn mittlerweile.
Mit Nika im Schlepptau flüchtet 47 und nimmt Kontakt mit dem CIA auf. Der ist grundsätzlich bereit, ihm zu helfen, wenn er denn im Gegenzug bereit ist, in Russland noch einmal seinem Job als Auftragskiller nachzugehen...